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華蒲公英的特性及其組織培養技術

來源:原創論文網 添加時間:2019-11-08

    摘    要:  華蒲公英具有較強的環境適應能力,是植物抗逆性研究的優良材料。通過多因素分析種子最佳消毒時間,萌發、增殖和生根培養基的最適激素濃度。結果顯示,最佳消毒方案為75%乙醇消毒30 s+無菌水沖洗2次+0. 1%升汞消毒10 min+無菌水沖洗5次,最佳萌發培養基的激素選擇是6-BA 0. 2 mg/L、GA3 1. 0 mg/L,最佳增殖培養基的激素選擇為NAA 0. 1 mg/L、6-BA 0. 5 mg/L,最佳生根培養基的激素選擇是NAA 1. 0 mg/L.通過實驗研究,篩選華蒲公英組培不同階段的培養基配方,建立華蒲公英組培體系。

  關鍵詞:  華蒲公英; 多糖含量; 增殖率; 干物率;

  Abstract:    Taraxacum borealisinense Kitam. isa perennial herb with the same source of medicine and food,belonging to Taraxacum, Compositae. In this study, we used Taraxacum borealisinense seeds as experimental materials and established the tissue culture system by optimizing culture conditions in each stage. The results showed that the optimumdisinfection method was that the material was disinfected with75 % ethanol for 30 s and rinsed with sterile water for twice,and then disinfected with 0. 1% mercuric chloridefor 10 min and rinsed with sterile water for four times. The optimal germination medium was MS medium supplemented with0. 2 mg/L6-BA and 1. 0 mg/L GA3. The optimal proliferation medium was MS medium supplemented with 0. 1 mg/L NAA and 0. 5 mg/L6-BA. The optimal rooting medium was MS medium supplemented with 1. 0 mg/L NAA. Through experiments,the medium formulations of different stages of tissue culture were screened to establish a system of dandelion tissue culture.

  Keyword:   Taraxacum borealisinense; polysaccharides content; multiplicationrate; drymattercontent;

  華蒲公英(Taraxacum borealisinense Kitam.)為菊科蒲公英屬植物,又名堿地蒲公英、鹼地蒲公英,為多年生草本植物,有較強的環境適應能力。在我國主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海、河南、四川、云南、江蘇等地。華蒲公英屬鹽生植物,適應性強,耐寒、耐熱、耐酸堿、耐瘠薄性均極強[1].

  華蒲公英甘、苦、寒、五毒,同蒲公英,歸肝、胃經。現代藥理表明,蒲公英具有良好的抗菌作用,是天然抗菌劑的重要來源之一。華蒲公英可食部分達到84%,且含有多種營養物質和具有保健作用的化學物質[2],在我國一些地區將華蒲公英作為蔬菜食用,如江蘇鹽城。蒲公英(Taraxacum mongolicum Handel-Mazzetti)、藥用蒲公英(Taraxacum officinale Weber)[3]等的植物組織培養已有報道,但針對華蒲公英的組織培養還未見相關報道。本文將參考蒲公英屬其他種的組織培養方法,并針對華蒲公英的特性,對其進行組織培養相關技術的研究。

  1、材料與方法

  1.1、 材料

  蒲公英種子采自鹽城市大豐港地區,經南京工業大學陳集雙教授鑒定為華蒲公英。選取120顆成熟飽滿的蒲公英種子作為實驗材料。
 

華蒲公英的特性及其組織培養技術
 

  1.2、 方法

  1.2.1、 蒲公英種子消毒

  配制培養基:MS+0.5 mg/L GA3+0.2 mg/L6-BA+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂pH 6.0,該配方通過前期預實驗獲得,灌裝到350 m L的組培瓶中,每瓶30 m L,并經高壓蒸汽滅菌(121℃20 min)冷卻后備用。

  用濾紙包裹蒲公英種子,在超凈臺內進行消毒:75%乙醇浸泡30 s,無菌水清洗2次;再用0.1%升汞浸泡1、10、15、20 min,無菌水清洗5次,接種于培養基上,并置于溫度(25±1)℃的培養室中暗培養15d,觀察記錄各組污染率及種子萌發情況。

  1.2.2、 萌發培養基篩選

  配制基本培養基MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L pH6.0,添加植物激素6-BA0.2 mg/L、GA3(0、0.5、1、2 mg/L),滅菌后備用。種子經外植體消毒后接種到培養基中,每瓶接種5顆,每個實驗組10瓶。置于培養室中進行培養:溫度(25±1)℃,暗培養5 d后進行光照培養(光照度1800~2000 Lux、光照周期14 h/d),培養時間為35 d,每間隔5 d統計并記錄每組發芽個數并繪制折線圖。

  1.2.3、 增殖培養基篩選

  增殖培養選擇MS固體培養基,針對NAA設立0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4個濃度梯度,每組10株,并按加入0.5 mg/L 6-BA,30 g/L蔗糖,5 g/L瓊脂,調節pH到6.0,滅菌后備用。將萌發的無菌苗切去根部并接種在培養基上,置于溫度(25±1)℃,光照度1800~2000 Lux,光照周期14 h/d的培養室中培養40 d.計算增殖率、干物率等。

  1.2.4、 生根培養基篩選

  生根培養基選擇1/2 MS為基本培養基,設立不同NAA濃度的0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4個梯度,每組10株,并添加活性碳(AC)0.1 g/L,30 g/L蔗糖,5 g/L瓊脂,調節pH到6.0,滅菌后備用。將增殖培養獲取的叢生苗在超凈臺中切成單株接種到培養基中,置于溫度(25±1)℃,濕度,光照強度1800~2000Lx,光照周期14 h/d的培養室培養40 d.測量根長、株高、葉片長寬,測定干物率和多糖含量[4].

  1.2.5、 數據分析

  使用Excel進行數據處理,用SPSS 22.0數據處理軟件進行顯著性分析。

  2、結果與分析

  2.1、 蒲公英種子外植體消毒條件篩選

  升汞(濃度0.1%)消毒時間對種子萌發和污染情況的影響見表1.結果表明,萌發率最高的組別為0.1%升汞消毒10 min,此時污染率最低且萌發率最高;升汞消毒只有1 min的組別出現污染,說明時間過短,消毒不徹底;升汞消毒時間在15 min及以上的組別均無種子萌發,可能是升汞毒性過大使外植體受損從而無法萌發。所以,考慮到乙醇的強透過性及升汞的毒性,消毒時間應控制在合理范圍內,因此蒲公英種子最適宜的外植體消毒方案是:75%酒精浸泡30 s,無菌水清洗2次,再用0.1%的升汞浸泡10 min,無菌水清洗5次。

  表1 不同0.1%升汞消毒時間下組別間萌發率及污染率差異
表1 不同0.1%升汞消毒時間下組別間萌發率及污染率差異

  2.2、 萌發培養基的篩選

  實驗表明不加赤霉素的空白組別相比,其余組別的萌發數幾近高出一倍(圖1),且通過圖3對比發現高濃度赤霉素組的葉片更大,說明赤霉素有促進芽萌發和葉片生長的作用;前10天赤霉素含量0.5 mg/L與2.0 mg/L的組別萌發數一致,10~30 d內0.5 mg/L的組別萌發率更高,但在后期與2.0mg/L組別一致,說明促進種子萌發的激素濃度不宜過高;GA3濃度1.0 mg/L的組別萌發率最高,其萌發速率最快的時期在10~25 d,后趨于穩定。

  圖1 不同赤霉素濃度的萌發情況
圖1 不同赤霉素濃度的萌發情況

  Fig.1 Effect of different contents of GA3 on germination rate

  如圖2,實驗結果最好的組別為GA3濃度1.0mg/L.

  2.3、 增殖培養基的篩選

  經過40 d的培養,蒲公英叢生苗數量顯著提升。每間隔10 d進行觀察統計,所有組別從第10天起幼苗開始生成愈傷組織和分化形成不定芽,隨后不定芽數逐漸增多并不斷生長。通過觀察發現,不含NAA的組別株高較其他組別更低,芽數少;NAA濃度0.1 mg/L的組別長勢最好;高濃度組別由于NAA的促進細胞分裂作用,易形成更多顆粒狀、質地疏松的愈傷組織,但分化出的不定芽較低濃度NAA更少,如圖3.

  植物激素NAA的不同濃度對華蒲公英叢生苗增值的影響見表2,結果顯示,激素濃度NAA=0.1mg/L時,組培苗的平均鮮重最高,但其干物率相較于高濃度NAA組別低,與不加NAA的組別相似。說明NAA濃度為0.1 mg/L時叢生苗的含水量高,代謝旺盛,是生長狀態最佳的濃度梯度組別。隨著NAA濃度的增加,干物率呈上升趨勢,與不含NAA的組別相比鮮重有所增加但增量逐漸降低,說明NAA只有在適宜濃度下才有最好的促生長作用。

  表2 不同濃度的NAA對增殖叢生苗鮮重和干物率的影響
表2 不同濃度的NAA對增殖叢生苗鮮重和干物率的影響

  2.4、 生根培養基的篩選

  2.4.1、 外觀及增殖情況

  不同的激素濃度對組培苗生根培養的影響見圖4,隨著NAA濃度的增加,蒲公英根粗增加,不定根數目增多,可大大提高移栽成活率;表3,平均根數隨NAA濃度升高而增加,但根長變短。根長與株高、蒲公英葉片數無必然聯系。NAA=0.5 mg/L時葉片長寬比最大,為17.9%且不定根數目增多。

  圖2 不同赤霉素濃度芽的萌發情況;
圖2 不同赤霉素濃度芽的萌發情況;

  Fig.2 Effect of different contents of GA3 on germination rate
  a.GA3=0(mg/L);b.GA3=0.5(mg/L);c.GA3=1.0(mg/L);d.GA3=2.0(mg/L)

  表3 不同濃度NAA下生根植株的生長狀態
表3 不同濃度NAA下生根植株的生長狀態

  圖3 蒲公英40天內增殖狀況;
圖3 蒲公英40天內增殖狀況;

  Fig.3 Taraxacum borealisinenseproliferation within 40 d

  a.接種第1天;b.生長10天;c.生長20天;d.生長30天;e.生長40天1:NAA=0(mg/L);2:NAA=0.1(mg/L);3:NAA=0.5(mg/L);4:NAA=1.0(mg/L)

  與對照組無激素的培養基相比,高NAA濃度的組別鮮重較高,可超出3倍;但干物率最低(表4),說明植株的含水量高,即新生幼嫩組織多,進一步印證了NAA有促進細胞分裂并加速植株代謝的功能。

  干物率最高的組別是NAA濃度0.1 mg/L,與其他實驗組具有顯著性差異。

  表4 不同NAA濃度對生根苗鮮重和干物率的影響
表4 不同NAA濃度對生根苗鮮重和干物率的影響

  圖4 不同濃度NAA下蒲公英生根情況
圖4 不同濃度NAA下蒲公英生根情況

  Fig.4 Rooting of Taraxacum borealisinense under different concentrations of NAA
  1 NAA=0(mg/L);2 NAA=0.1(mg/L);3 NAA=0.5(mg/L);4 NAA=1.0(mg/L)

  2.4.2、 多糖含量

  大量資料顯示,蒲公英的多糖主要集中在根部,可占到干重的40%~50%,其次是莖、葉,約有10%.壯苗培養基的主要目的是促使植株形成更多、更粗壯的根部,以便提高在后續移栽等過程中的成活率。因此,多糖的含量為生根培養基的重要衡量標準。由表5,NAA濃度越高,多糖在植株鮮重及干重中的比例也越高。當NAA濃度為0.5 mg/L和1.0 mg/L達到最高,與低濃度的NAA存在顯著的差異。

  表5 不同NAA濃度對生根苗多糖含量的影響
表5 不同NAA濃度對生根苗多糖含量的影響

  3、結論與討論

  1)以華蒲公英種子為實驗材料進行無菌消毒,采用75%的乙醇與0.1%的升汞聯合消毒,固定乙醇的浸泡時間30 s,篩選出升汞的浸泡時間為10min,高于該時間種子未出現污染,但也未萌發,原因是升汞浸泡時間過長對華蒲公英種子的胚體毒害較大。華蒲公英種子消毒的過程為首先將種子清水洗凈,其次在超凈臺中用75%的乙醇浸泡30 s,無菌水沖洗2次,最后再用0.1%的升汞浸泡10 min,無菌水沖洗5次。由于蒲公英的種子太小浸泡消毒很不便,因此將種子包裹在單層紗布中進行消毒。

  2)赤霉素(GA3)是一種高效調節植物生長的激素,它通過促進細胞數量的增加個細胞伸長而促進植物的生長發育。在農業生產中GA3多被用作打破種子休眠促進種子萌發,如陳藝芳等[5]研究表明一定濃度GA3能夠促進沙氏鹿茸草種子的萌發,牛宋芳[6]等發現GA3與鹽交互作用能夠促進紅砂種子的萌發,代建麗等[7]研究表明在白及種子的無菌培養中,0.5%的GA3能夠促進其萌發,萌發率高達90%.本文在MS培養基中添加不同濃度的GA3,發現當GA3的濃度為1.0 mg/L華蒲公英種子的萌發率最高,后期的組培苗的長勢也較好。

  3)在華蒲公英的增殖培養中,我們篩選出了最佳的激素配方是NAA 0.1 mg/L、6-BA 0.5 mg/L.NAA與6-BA的不同組合廣泛的應用在植物組織培養中的增殖或誘導叢生芽培養,如賈明良等[8]對半夏的組織培養中,發現當NAA的濃度為0.05 mg/L、6-BA 1.0 mg/L時,組培苗的增殖率最高、長勢最好。唐蓉等[9]發現在試管培養蒲公英(T.mongolicum)芽形成階段6-BA和KT與NAA或IAA結合使用時比單獨使用6-BA和KT效果更為顯著。

  4)在華蒲公英的生根培養中,我們采用的是1/2MS為基礎培養基,并添加活性炭(AC)(0.3 mg/L),優化了NAA的濃度為0.5 mg/L時生根苗長勢最好,其組織內的可溶性多糖含量也較高,植物內的多糖與植物的抗逆性正相關[10],說明該濃度下培養的華蒲公英生根苗移栽后成活率較高。

  參考文獻

  [1]馬麗賢,董寬虎.鹽堿脅迫對華蒲公英質膜ATP酶和5'-核苷酸酶的影響[J].草地學報,2010,18(4):556-559.
  [2]孫懷娟,魏小弟.蒲公英的組織培養研究[J].熱帶農業科學,2008,28(3):4-7.
  [3]陳華,李平,劉晶,等.藥蒲公英再生體系的建立和優化[J].生物工程學報,2005,21(2):244-249.
  [4]張本厚,胡燕花,金磊磊,等.鐵皮石斛組培體藥用和營養成分含量的比較[J].江蘇農業科學,2015,43(10):324-327.
  [5]牛宋芳,王利娟,劉秉儒.赤霉素對鹽脅迫下紅砂種子萌發的影響.草業學報,2017,26(6):89-97.
  [6]陳藝芳,郭巧生,朱再標,等.赤霉素濃度和溫度對沙氏鹿茸草種子萌發影響研究[J].中藥材,2018,5:1040-1043.
  [7]代建麗,張露,郭鮮蒲,等.赤霉素及光照對白芨種子無菌萌發的影響[J].種子,2016,7:18-21.
  [8]賈明良,方荷芳,張本厚,等.三葉半夏叢生塊莖途徑擴繁及分離技術研究[J].中國農業科技導報,2016,18(6):181-186.
  [9]唐蓉,韋梅琴,熊增宏.蒲公英試管培養中芽形成的研究[J].青海大學學報(自然科學版),2005,23(2):62-65.
  [10]黃俊哲,馬宏宇,李永飛,等.西北地區黑果枸杞抗逆行研究進展[J].安徽農業科學,2017,45(15):132-133.

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